如何利用離心機(jī)提取乳酸脫氫酶及輔酶

發(fā)布時間：

2021-02-23

概要：

如何利用離心機(jī)提取乳酸脫氫酶及輔酶，先來了解下概念以及作用，提取過程不易，總要明確提取目的。

　　先來了解下概念以及作用，提取過程不易，總要明確提取目的。

　　乳酸脫氫酶及輔酶概念：

　　乳酸脫氫酶(LDH或LD)是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，可催化丙酮酸與L-乳酸之間的還原與氧化反應(yīng)，也可催化相關(guān)的α-酮酸。LDH廣泛存在于人體組織中，以心、腎、骨骼肌含量最高，肝、脾、胰和肺組織次之。LDH測定方法主要有比色法和連續(xù)監(jiān)測法。

　　輔酶（coenzyme）是一類可以將化學(xué)基團(tuán)從一個酶轉(zhuǎn)移到另一個酶上的有機(jī)小分子，與酶較為松散地結(jié)合，對于特定酶的活性發(fā)揮是必要的。有許多維他命及其衍生物，如核黃素、硫胺素和葉酸，都屬于輔酶。這些化合物無法由人體合成，必須通過飲食補(bǔ)充。

　　乳酸脫氫酶及輔酶作用：

　　乳酸脫氫酶由酶蛋白和輔酶Ⅰ組成，兩者單獨(dú)存在時，無催化活性，必須共同存在組成全酶才起作用。乳酸脫氫酶廣泛存在于各種組織細(xì)胞，在代謝過程中有重要意義，它可逆地催化乳酸脫氫形成丙酮酸或丙酮酸接受氫生成乳酸，反應(yīng)中由輔酶Ⅰ（NAD＋）起傳遞氫的作用。乳酸脫氫酶屬于不需氧脫氫酶，不能直接將氫交給氧，反應(yīng)中生成的還原型輔酶I，可與其他酶蛋白結(jié)合，將氫傳給其他的遞氫體，通過呼吸鏈被徹底氧化。

　　利用離心機(jī)提取乳酸脫氫酶及輔酶得方法：

　　本實(shí)驗(yàn)以乳酸為底物。用新鮮的動物肝臟或肌肉組織的粗制提取液，分別制成酶蛋白部分（用白陶土吸附除去輔酶Ⅰ）和輔酶部分（加熱破壞酶蛋白），觀察兩者單獨(dú)作用及共同作用的情況。實(shí)驗(yàn)中為了便于觀察，用甲烯蘭（美蘭）作為受氫體，已知甲烯蘭能從還原型黃酶接受氫而由藍(lán)色變成白色（甲烯白）。所以本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)溶液藍(lán)色的消褪情況判斷乳酸脫氫反應(yīng)的發(fā)生。

　　實(shí)驗(yàn)器材

　　水浴鍋；離心機(jī)；離心管；試管；研缽；剪刀；鑷子；實(shí)驗(yàn)動物（小鼠、大鼠或兔）。

　　實(shí)驗(yàn)試劑

　　1．玻璃砂　充分洗凈。

　　2．0．1MpH7．4磷酸緩沖液　稱取Na2HPO411．92g，KH2PO42．18g，加水定容至1升。

　　3．白陶土　用于吸附輔酶Ⅰ。

　　4．0．5%KCN液　稱取KCN　0．5g，加水溶解成100ml。

　　5．5%乳酸鈉溶液　稱取乳酸鈉5g，加水溶解成100ml。

　　6．0．04%甲烯蘭液　稱取甲烯蘭0．04g，加水溶解成100ml。

　　實(shí)驗(yàn)方法

　　1．分別制備酶蛋白提取液及輔酶Ⅰ提取液

　　（1）除去輔酶Ⅰ的酶蛋白提取液：取新鮮動物肝（或肌肉）組織3g，剪碎放研缽中加玻璃砂約0．5g，白陶土0．5g，加pH　7．4　0．1M磷酸緩沖液8ml，研成細(xì)粥狀。移入離心管中，以2000rpm離心機(jī)離心5min，傾于另一試管中備用。